RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA - SEPARAÇÃO DE PIGMENTOS FOTOSSINTÉTICOS PELA TÉCNICA DA CROMATOGRAFIA DE PAPEL

INTRODUÇÃO

     Os pigmentos dos cloroplastos localizam-se nos tilacóides, associados às membranas lipoprotéicas. Suas principais funções são a absorção da energia radiante e a transferência dessa energia a uma série de compostos oxirredutíveis, os quais permitem a formação de O2, ATP e NADPH + H+. O pigmento que participa diretamente da transferência de elétrons é apenas a clorofila a, enquanto a clorofila b e os carotenóides têm uma atuação indireta, transferindo a energia luminosa à clorofila a.

      Cada tipo de pigmento tem uma estrutura química definida com um padrão característico de duplas ligações conjugadas que determina a absorção seletiva de certos comprimentos de onda, fazendo com que cada pigmento apresente coloração específica. Assim a clorofila a é verde-azulada, a clorofila b é verde-amarelada, as xantofilas são amarelas e os carotenos são alaranjados. Além das cores esses pigmentos apresentam diferentes afinidades pelos diversos solventes orgânicos e pela água, em função da proporção dos radicais hidrofílicos ou hidrofóbicos que cada um deles possui.

         Uma técnica extremamente simples que permite a separação destes pigmentos é a cromatografia de papel e se baseia na partição líquido-líquido dos compostos, quando tiras de papel filtro servem como suporte de uma fase aquosa e uma fase móvel orgânica se dirige para o ápice ou extremidade da cromatografia.

OBJETIVOS

        Separar e identificar os pigmentos fotossintéticos pela técnica da cromatografia de papel.

MATERIAIS

      Folhas verdes de qualquer espécie e variegadas de cóleos ou de Tradescantia sp; Lâmina de barbear ou bisturi; Almofariz (gral); Acetona e algodão hidrófilo; Papel de filtro; Placa de Petri; Funil de vidro, tubos de ensaio e suporte; Fonte de luz ; NaOH 0,1 N; HCl 0,1 N.

MÉTODOS

Parte 1 – Observação do fenômeno da Fluorescência

1. Corte 5-10 folhas verdes e variegadas em pedaços pequenos num almofariz;

2. Coloque um pouco de acetona e macere;

3. Filtre o homogenado em algodão e papel de filtro e receba o filtrado em um tubo de ensaio;

4. Observe a coloração do extrato sob a ação da luz direta e refletida;

Parte 2 – Cromatografia em papel

1. Marque o centro de um disco de papel de filtro com um ponto a lápis (não use tinta e nem dobre o papel).

2. Com uma pipeta ou conta-gotas, coloque uma gota do extrato. Deixe a gota secar um pouco e coloque outra gota. Continue gotejando (5-7gotas), sempre sobre o mesmo ponto, até que surjam vários círculos coloridos no disco;

4. Se surgirem discos azulados ou avermelhados no disco coloque uma gota de solução ácida (HCl) ou básica (NaOH) sobre os mesmos. Observe o que acontece.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

CONCLUSÃO

Conclui-se que a luz excita os elétrons, fazendo com que a luz azul passe de S1 para S2 emitindo assim fluorescência. Quando o estrato foi colocado sob a ação da luz direta e refletida ocorreu à emissão de fluorescência da cor verde. E quando foi realizada a cromatografia em papel foi observada a separação dos pigmentos.

QUESTÕES

1. Identifique os pigmentos presentes no extrato, caracterizando-os quanto a faixas de absorção de luz, solubilidade e localização celular.

• Clorofilas: Esta molécula é insolúvel em água, mas solúvel em compostos orgânicos como o éter, o benzeno e a acetona devido às propriedades apolares do fitol. Elas dão coloração verde às plantas e quando dissolvidas também formam soluções com coloração verde intensa. Embora absorvam radiação em todos os comprimentos de onda do espectro do visível, têm alguns picos de absorção nas regiões do azul-violeta (400 nm) e do vermelho (600 nm), o que faz com que surjam com coloração verde, uma vez que é a cor que refletem.
• Carotenóides: Apresentam colorações que vão desde o amarelo ao castanho, passando pelo laranja e pelo vermelho. A sua cor só é visível durante o Outono, pois no resto do ano estão mascarados pelas clorofilas. Os carotenóides estão presentes nos cloroplastos sob a forma de complexos proteicos insolúveis em água. As suas funções fundamentais são a absorção da energia luminosa e proteção das clorofilas contra os fenómenos de fotoxidação. Estes pigmentos surgem com tonalidades vermelhas e avermelhadas, pois absorvem nas regiões do azul e do verde.

2. Caracterize a partição dos mesmos no processo fotossintético.

      Apenas a clorofila a que participa diretamente da transferência de elétrons. Já a clorofila b e os carotenóides, atuam de forma indireta transferindo a energia luminosa à clorofila a.

3. Como explicar o comportamento da clorofila quando exposta à luz direta e refletida? 

       A clorofila é o pigmento que confere a cor verde às folhas, e absorve principalmente a luz nos comprimentos de onda violeta e azul bem como no vermelho: devido ao fato de ela refletir a luz verde, a clorofila se apresenta verde. Quando a clorofila é exposta à luz direta sobre fluorescência. pois suas moléculas absorvem a energia da luz, elevando portanto, momentaneamente, os elétrons para níveis mais altos de energia , depois os elétrons retornam outra vez para um nível mais baixo. A maior parte desta energia é liberada como luz. A energia absorvida pelas moléculas de clorofila isoladas não pode ser convertida em qualquer forma de energia útil para os sistemas vivos. A clorofila pode converter energia luminosa em energia química apenas quando as moléculas de clorofila estão associadas a certas proteínas embebidas nas membranas especializadas dos tilacóides.

4. Caso tenham surgido os círculos azulados ou avermelhados, identifique os pigmentos responsáveis pelos mesmos e explique o comportamento dos mesmos em presença do ácido ou de uma base.

       Não houve o surgimento de círculos azulados ou avermelhados no disco de papel de filtro quando acrescentado solução ácida ou básica. Ocorreu apenas a separação dos pigmentos.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

         Roteiro adaptado de:

MAESTRI et al. Fisiologia Vegetal (exercícios práticos), Viçosa. Editora UFV, 1998. FREITAS, H.M.B. Manual de Atividades Práticas de Fisiologia Vegetal, Salvador: Edufba, 2006.